超純水在PCR檢測中的作用

今天帶大家走入核酸檢測的常用方法PCR方法，以及如何在PCR檢測過程中降低檢測結(jié)果假陰性概率。

一、什么是PCR技術(shù)?

PCR技術(shù)又稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。是一種用于放大擴增特定的DNA的片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的大特點是能將微量的DNA大幅增加。

在病毒檢測中，核酸檢測被定義為臨床診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，RT-PCR技術(shù)被反復(fù)提到，它是一種將RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR相結(jié)合的技術(shù)。首先在反轉(zhuǎn)錄酶.的作用下，將提取到的RNA合成cDNA,再以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下不斷擴增(變性-退火-延伸多個循環(huán))合成目的片段并進行分析。

二、PCR用水

PCR技術(shù)目前多搭配試劑盒使用，也有用戶自行制備反應(yīng)體系，無論哪個過程都需要使用水。無論是近年來季節(jié)性爆發(fā)的甲流乙流，還是目前都在經(jīng)歷的病毒，在檢測過程中都涉及一個痛點，那就是如何盡可能提高核酸檢測的準(zhǔn)確性，減少假.陰性結(jié)果出現(xiàn)的可能性。

我們首先分析一下假陰性結(jié)果出現(xiàn)的原因，以病毒核酸檢測為例，假陰性的主要原因有:

1病人病程:不同病程，患者體內(nèi)病毒載量不同;

2采樣部位:咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等不同采樣部位病毒載量均不同;

3采樣準(zhǔn)確性:拭子質(zhì)量，工作人員操作等;

4試劑盒的質(zhì)量:引物設(shè)計以及水質(zhì)控制。

為了順利將提取到的RNA反轉(zhuǎn)錄并實現(xiàn)DNA的成功擴增，必須抑制核糖核酸酶(RNases)的降解作用，如果試劑盒用水內(nèi)含RNases，將極有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

三、去除RNases的主要方法

1高壓滅菌:即便是在180°C下高壓滅菌4h之后，RNases仍保持某些活性，且某些細菌失活會釋放更多的RNases;

2 DEPC法(二乙基焦碳酸酯處理法) :利用二乙基焦碳酸酯(DEPC) 處理方法使酶失活是用來抑制水溶液中RNases活性的常見方法。然而，二乙基焦碳酸酯是一種可疑致癌物，處理須小心;同時該方法雖然能夠使酶失活，卻無法將其從水中去除，同時清除多余的DEPC過程中，會產(chǎn)生乙醇，二氧化碳等其他污染物;

3超濾法:超濾是一種真正能夠從水溶液中清除RNases的方法。

四、超濾膜介紹

超濾膜被大量用于水處理工程。超濾技術(shù)在反滲透預(yù)處理、飲用水處理、中水回用等領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。超濾技術(shù)在酒類和飲料的除菌與除濁，藥品的除熱原以及食品及制藥物濃縮過程中均起到關(guān)鍵作用。

超濾過濾孔徑和截留分子量的范圍一直以來定義較為模糊，一般認為超濾膜的過濾孔徑為0.001-0.1微米，截留分子量(Molecular weigh cut-off, MWCO)為1,000-1,000,000 Dalton。嚴格意義上來說超濾膜的過濾孔徑為0.001-0.01微米，截留分子量為1,000-300,000 Dalton。若過濾孔徑大于0.01微米，或截留分子量大于300,000 Dalton的微孔膜就應(yīng)該定義為微濾膜或精濾膜。

一般用于水處理的超濾膜標(biāo)稱截留分子量為30,000-300,000 Dalton，而截留分子量為6,000-30,000 Dalton 的超濾膜大多用于物料的分離、濃縮、除菌和除熱源等領(lǐng)域。

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